Jerónimo Costa, se levanta contra Buenos Aires en noviembre de 1854, y para hallar soluciones pacíficas Urquiza designó a José María Cullen y a Daniel Gowland, representantes suyos ante el gobernador Pastor Obligado. La provincia disidente nombró con igual carácter a Ireneo Portela. De esta manera surgió el convenio del 20 de diciembre (1854).
Finalmente la situación se hizo tiante, hubo desacuerdo, los pactos fueron denunciados, el recurso de las armas era la única salida posible, a pesar de que Urquiza no desistió de hallar una salida por vía pacífica. Como última solución el Congreso de la Confederación autorizó a Urquiza a resolver por la paz o la guerra la situación del Estado disidente.
Mientras se hacían los aprestos para la guerra, unidades de la escuadra porteña vigilaban el río Paraná para evitar en lo posible el paso de las fuerzas entrerrianas. La escuadra de la Confederación se hallaba por entonces en Montevideo armando algunos de sus buques. Hasta mediados de 1859 la flotilla de Buenos Aires predominó en los ríos. El Guardia Nacional recorría el Uruguay, el General Pintos y el Buenos Aires se hallaban frente al Paraná al mando del almirante Murature para impedir el paso de fuerzas de la Confederación, que había ordenado a su escuadra que avanzase desde Montevideo, forzando el paso de Martín García.
El 7 de julio por la mañana la tripulación del General Pintos se sublevó al grito de “¡Viva la Confederación Argentina!”. A bordo de la nave se encontraba el comandante del Buenos Aires, Alejandro Murature, quien quiso contener a los amotinados pero murió en la lucha; su padre, el almirante, también fue herido. Así Urquiza pudo pasar tranquilamente su flota a la ribera de Santa Fe. Urquiza albergó en su casa a Murature y ordenó se celebrase las exequias del hijo muerto.
Mientras en ambos sectores se intensificaban los preparativos para la guerra, intervino como mediador el ministro de los Estados Unidos, Mr. Benjamín Yancey, que ofreció al general Urquiza sus buenos oficios a fin de evitar el derramamiento de sangre. Al comienzo Alsina dudaba de la buena disposición del presidente y no quiso pactar ningún armisticio previo como pedía el ministro mediador norteamericano. Después de varias conferencias los comisionados del gobierno de Buenos Aires: Mármol y Vélez Sársfield, propusieron como condición ineludible el retiro de Urquiza, entre otras cosas. Ante esta actitud Mr. Yancey dio por terminada su intervención amistosa.
En el ínterin otro hecho contribuyó a aumentar la tensión: San Juan había sido intervenida en 1857 a consecuencia de un motín que derrocó a las autoridades constituidas; se designó a Nicanor Molinas, que regresaba de cumplir igual misión en La Rioja. El gobierno de Gómez Rufino, primer gobernador constitucional de la provincia, temeroso del caudillo sanjuanino Nazario Benavídez, a cargo de la circunscripción militar, lo redujo a prisión el 19 de septiembre de 1858, lo encerró en un calabozo, y pese a su edad avanzada, le puso una barra de grillos de arroba.
El vicepresidente que estaba a cargo del Poder Ejecutivo, Salvador María del Carril, en decreto refrendado por Derqui, designó una comisión para poner en libertad al detenido. Antes de la llegada de los comisionados, Benavídez fue asesinado en el calabozo el 23 de octubre. Se pensó que este asesinato había sido realizado por sugerencia de los porteños.
La provincia fue intervenida y el Congreso Federal votó en abril de 1859 una ley que encomendaba a Urquiza la reincorporación de Buenos Aires. En los preliminares de la batalla Urquiza tenía una escuadra compuesta de 9 buques con 68 cañones y ese poderío, unido a las fortificaciones y baterías de Rosario y Paraná, le dio poder beligerante en el río que antes era dominado por la escuadra porteña. Además Urquiza contaba con el apoyo de 13 provincias.
En Buenos Aires se debía articular un ejército que permitiera medirse con los efectivos que Urquiza iba a atacar. Desde junio de 1859, Mitre hizo proezas para organizar e instruir las tropas novicias y reunir caballadas, que no abundaban en la región del norte de la provincia a causa de una prolongada sequía. Tampoco abundaba la alimentación para los hombres y debía llevarse desde regiones distantes o después de largas marchas desde la capital o por el río.
Mitre instaló en San Nicolás, cerca de la línea del Arroyo del Medio, una base natural de defensa contra la probable invasión; además el puerto le permitía desembarcar hombres, material de guerra y equipo para sus tropas enviados desde la capital. Mitre disponía de 9.000 hombres, de los cuales 4.700 eran de infantería, 4.000 de caballería, con 24 piezas de artillería.
Urquiza tenía un ejército de 14.000 hombres; 10.000 eran de caballería, 3.000 de infantería, con 35 piezas de artillería, y acampaba al norte del arroyo Pavón. Mitre ocupó la Horqueta de la Cañada o arroyo de Cepeda.
Los ejércitos de la Confederación y el de Buenos Aires libraron el 23 de octubre de 1859 la batalla en Cepeda. Las tropas de Buenos Aires estaban al mando del coronel Rivas, el comandante Adolfo Alsina, Morales, Rivera, Emilio Mitre, Conesa, Lézica y Díaz de Arredondo; la artillería la dirigía el coronel Nazar; la caballería tenía al frente los coroneles Hornos y Flores. La batalla comenzó en la madrugada del 23 y duró todo el día. Cepeda no fue una batalla de aniquilamiento, aunque del ejercito de Buenos Aires sólo se salvaron unos 2.000 hombres de infantería pero fue una derrota en regla para los porteños.
Al día siguiente de la batalla de Cepeda, Urquiza lanzó una proclama al pueblo de Buenos Aires. Los coroneles Lagos, Laprida, Lamela y otros fueron adelantados con las divisiones ligeras para contener los saqueos de los dispersos e incorporarlos al ejército, invitando a las poblaciones a pronunciarse por la causa de la Confederación. Desde su cuartel en marcha sobre Luján, Urquiza dictó un decreto de amnistía e indulto general. El 3 de noviembre las avanzadas de su ejército llegaron hasta Flores. Cuatro días después Urquiza acampó con el grueso de sus tropas, alrededor de 20.000 hombres; poco antes habían llegado por el río los salvados de Cepeda.
En el curso de las guerras civiles no se había reunido un ejército tan numeroso.
Buenos Aires fue sitiada por segunda vez.
Antes del combate terrestre hubo una acción naval en Martín García, en la que la escuadra de la Confederación, al mando del almirante Mariano Cordero, forzó el paso pese a la acción combinada de las baterías terrestres y naves porteñas, el 14 de octubre.
El hijo del presidente paraguayo Carlos López, Francisco Solano López, estaba en Buenos Aires esperando la respuesta a sus gestiones para lograr un armisticio y discutir propuestas de paz. El 27 de octubre, recibió una notificación del gobierno de Buenos Aires según la a cual se le reconocía los servicios y el empeño que había puesto en el éxito de la mediación y se le facilitó los medios para que se pusiera en comunicación con el jefe de la Confederación. Fue así como puso en conocimiento de Urquiza que el gobierno de Buenos Aires estaba dispuesto a enviar comisionados para tratar la paz. Desde el cuartel general en marcha sobre Luján, Urquiza hizo saber a Solano López que recibiría comisionados. El 2 de noviembre fueron nombrados por el gobierno de Buenos Aires comisionados Juan Bautista Peña, Carlos Tejedor y Antonio Cruz Obligado. Por parte del presidente de la Confederación fueron designados los generales Tomás Guido y Juan Pedernera y el diputado Daniel Aráoz. La primera conferencia se llevó a cabo en la chacra de Monte Caseros. Estas negociaciones se vieron interrumpidas por no llegarse a un acuerdo a las exigencias entre ambos sectores.
La conferencia se reanudó el 9 de noviembre. Ambas partes flexibilizaron sus posiciones. Buenos Aires aceptó la integración con el resto del país, la renuncia de Alsina, y la vigencia, previo análisis de la Constitución Nacional. Además, y hasta tanto se aplicara la nueva ley de Aduanas, haría un adelanto de divisas al país.
La mayor disposición de Urquiza permitió finalmente llegar a un acuerdo, firmándose el 11 de noviembre de 1859 el pacto de Unión Nacional, conocido también como Pacto de San José de Flores.
Buenos Aires ingresó a la Confederación en un pie de igualdad con el resto de las provincias. Comenzaba finalmente la esperada tarea común de la organización nacional.
Una convención porteña reunida en enero de 1860 examinó la Constitución de 1853 y le introdujo algunos cambios.
La Convención Nacional, reunida en Santa Fe el 23 de septiembre de 1860, aceptó la mayor parte de las enmiendas.